PRACTICA 14: DETERMINACION HDL COLESTEROL D

DERTERMINACION CUANTITATIVO DE COLESTEROL HDL

PRINCIPIO DEL METODO
Determinación directa del HDLc (colesterol de lipoproteinas de alta densidad) sin necesidad de pre/tratamiento o centrifugado de la muestra. La determinación se realiza en dos pasos;
1. Eliminación de lipoproteinas no/HDL
         esteres colesterol        coleasterol  ácidos grasos
         colesterol   O2              colestenona   H2O2
         2  H2O2                          2H2O   O2

2. Medición de HDLc
        esteres colesterol           colesterol    ácidos grasos
        colesterol  O2                  colestenona  H2O2
      2 H2O2   HDAOS   4/AA        pigmento quinona   4H2O

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de HDLc presente en la muestra ensayada

SIGNIFICADO CLINICO
Las partículas de HDL son lipoproteinas se alta que transportan el colesterol desde los tejidos del cuerpo hasta el higado. Debido a que las HDL pueden retirar el colesterol de las arterias y transportarlo de vuelta al higado para su excreción, se les conoce como el colesterol o lipoproteina buena, ya que niveles elevados están relacionados con un menor riesgo cardiovascular. Un nivel bajo de colesterol HDL es considerado uno de los principales factores de riesgo cardiovascular y enfermedades de arterias coronarias.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

REACTIVOS
R1           Extrae selectiva mente todo el colesterol menos el HDL
                Formado por N, N/bis (2/hidroxietil)/2/aminoetanosulfonico ácido pH 6,6
                N/(2/hicroxi/3/sulfopropil) 3,5 dimetoxinilina (HDAOS)
                Colesterol eesterasa
                Colesterol oxidasa
                Catalasa
                Ascirbico oxidasa
R2           Extrae por sustancias jabonosa el HDL
                Formado por N,N/bis (2/hidroxietil(/2/aminoetanosulfonico ácido pH 7,0
                4/aminoantipirica  (4/AA)
                Peroxidasa
HDLc/LDLc  Cal        Es el calibrador, formado por suero humano liofilizado







PREPARACIÓN
Debemos reconstruir el calibrador. Para eso debemos añadir al vial 1 ml de agua destilada. Lo tapamos y mezclamos suavemente hasta disolver su contenido.
De mantendrá estable durante 30 horas a 20/25C

MATERIAL

  • Espectrofotometro o analizador con cubeta para lecturas a 570nm
  • Cubetas de 1,0 cm de paso de luz
  • Equipamiento habitual de laboratorio

MUESTRAS
Usamos suero de paciente que estaba congelado. Lo sacamos un rato antes para atemperarlo.

PROCEDIMENTO
Encendemos el Espectrofotómetro y configuramos para una lectura a 578nm
Los tubos de ensayo los rotulamos para hacer el blanco, el calibrador (común para todo el grupo) y una muestra para cada uno.
En el tubo de BLANCO pipeteamos 300ul de R1
En el tubo de CALIBRADOR pipeteamos 300ul de R1 y 3ul de HDLc/LDLc CAl
En el tubo de la MUESTRA pipeteamos 300ul de R1 y 3ul de muestra


Incubamos en el baño maría a 37C durante 5 minutos.


 Trascurrido este tiempo medimos las absorbancias
A BLANCO: 0,00 A
A CALIBRADOR: 0,040 A
A MUESTRA: O,306 A
Ahora a todos los tubos añadimos 100ul de R2.
Lo dejamos incubar en el baño maría durante 5 minutos y volvemos a medir las absorbancias.
A BLANCO: 0,00 A
A CALIBRADOR: 0,279 A
A MUESTRA: 0,787 A
Aplicamos los resultados obtenidos a la fórmula:
[(A2/A1) de la muestra / (A2/A1) del patrón ] x la concentración calibrador
[0,787/ 0,306)/(0,279/0,040)] x 33,2
0,481/0,239 x  33,2
66,8 mg/dL

Nuestro ensayo nos resulta un riesgo menor

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